用于体外转录的模板DNA可以包括线性化的质粒DNA、合成的DNA以及PCR产物。请查看用于模板DNA制备的缓冲液、试剂、限制性内切酶、PCR酶和试剂盒，以及DNA提取产品。

模板DNA必须去除杂质，如细菌内毒素、反应组分及残留污染物。ReliaPrep™ DNA Clean-Up and Concentration System旨在快速浓缩并纯化稀释的DNA溶液，以及提取和纯化100bp至10kb大小的DNA片段。Wizard^® SV Gel and DNA Clean-Up System用于从琼脂糖凝胶中或直接从PCR扩增反应中提取和纯化DNA片段。

如何制备体外转录用的模板

RiboMax™RNA生产系统提供了进行体外mRNA合成所需的所有组分和缓冲液，包括RQ1无RNase的DNase，用于IVT反应后消化模板DNA。

T7RiboMAX™ Express大规模RNA生产系统是一种为短时间内稳定生产大量RNA而设计的IVT系统。使用该试剂盒已成功生成了高达14kb的毫克级高质量RNA转录本。

RiboMAX™大规模RNA生产系统能够合成长达23kb的带帽或不带帽的大规模RNA转录本，并且可以在转录产物中掺入修饰核苷酸。

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RiboMAX™ 体外转录反应产生的RNA产量可扩展到至少10ml。

图示为每ml IVT反应的产量（左图）和总产量（右图）。每个重复的RiboMAX™ 反应以单独的柱状图表示。按照上文工作流程图中描述准备RiboMAX™IVT反应。使用T7线性对照DNA（目录号P141A）作为模板（每反应100μg/ml），分别准备了双份的100μl、1ml、5ml和10ml反应。另外，还准备了双份无RNA聚合酶的对照（0.1ml – NE）。转录反应在37°C下孵育4小时。转录后，将RiboMAX™ 反应液稀释100倍于无核酸酶水，并使用Qubit™ RNA BR Assay（Invitrogen）对10μl样品进行测定，以评估RNA产量。

大规模IVT试剂盒比较。

使用RiboMAX™ 大规模RNA生产系统-T7、HiScribe™ T7高产RNA合成试剂盒和TranscriptAid™ T7高产转录试剂盒合成了1.8kb的萤光素酶转录本和5kb末端终止转录本，转录反应中含有标准核苷酸（Std.）、N1-甲基假尿苷（U）及N1-甲基假尿苷+5-甲基胞苷（U+C）。转录过程中使用CleanCap^® Reagent AG（3’ OMe）进行共转录加帽反应，遵循此处描述的实验方案。左侧：转录产物按1:100的比例稀释于无核酸酶水中，并使用RNA ScreenTape Assay进行分析。展示了使用各试剂盒合成的转录产物的凝胶图像。条带按各泳道最高峰进行缩放（按样本缩放）。右侧：使用柱式RNA纯化试剂盒纯化1.8kb转录本，并采用QuantiFluor^® RNA System（目录号E3310）进行定量。展示的是纯化后的1.8kb转录本浓度及产量结果。

体外转录（IVT）反应之后，需要将mRNA从反应混合物中纯化出来，以防止反应组分对下游mRNA应用产生抑制。纯化过程同时也浓缩了mRNA。ProNex^®分子量选择性纯化系统是一种基于磁珠的技术，可以提供一种简便、快速、高效且便于自动化的方法来进行RNA纯化。

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右图：两种磁珠法RNA纯化化学体系的平行比较。使用50ul预纯化的RNA，依据生产商推荐的实验方案，分别采用ProNex^® 分子量选择性纯化系统和一种竞争性试剂盒进行纯化。