使用 NAD/NADH-Glo™ Assay 检测 PARP 活性
DNA损伤时, PARP活性被上调。单体NAD(+)被消耗,并在损伤处经酶促聚合反应形成聚ADP核糖基化链,或将单ADP核糖添加至目标底物中。
生物发光NAD/NADH-Glo™ Assay是一种可在细胞裂解物等生物样品中,检测NAD(+)和NADH,并测定其比例的均质测定法。简单的“加样-读取”模式可适用于高通量筛选。可根据实验需求调整方案,用于测量PARP和其他酶的活性。
上图. PARP活性检测。在384孔板中,在含有PARP1、375ng核小体和20μMNAD的反应中测量PARP1活性。经过一小时孵育后,通过添加同等体积的经修改的NAD/NADH Glo™ Detection Reagent,分析NAD水平。20分钟后,记录发光信号。图A:滴定PARP1酶(体积:5μl)。图B:PARP1抑制
使用 AMP-Glo™ Assay 检测 PARP 活性
AMP-Glo™ Assay是一种从任何生成AMP的生物化学反应中产生发光信号的均质性检测。可用于检测多种酶的活性,例如环状AMP特异性磷酸二酯酶、氨酰基tRNA合成酶、DNA连接酶和泛素连接酶或由AMP调节的酶。
参见使用该测定法监测聚ADP核糖基化的文献:
Mondal, S., Hsiao, K. and Goueli, S.A.(2017) Utilityof Adenosine Monophosphate Detection System for Monitoring theActivities ofDiverse Enzyme Reactions. ASSAY and Drug DevelopmentTechnologies 15,300–341.
上图. 使用修改的AMP-Glo™ assay测定ADP核糖基化。图A:核小体上PARP1的聚ADP核糖基化。使用50μg/ml核小体、20μM NAD + 和不同量的PARP1进行含有PARP1活性的反应,并使用AMP-Glo™系统分析。图B:测定DPQ对 PARP1的抑制作用。