丝裂原激活的蛋白激酶（MAPK）是一个大型蛋白质家族，负责调节真核生物中的各种细胞功能，包括基因表达、增殖、分化和凋亡（1）。MAPK信号通路通常包括三个按顺序激活的激酶，这些通路会响应胞外刺激被触发，如细胞因子、促增殖因子、生长因子和氧化应激（1）。最终，信号被传送到细胞核，激活特定的转录因子调节一个或多个基因的表达。

在MAPK通路中，RAS-RAF-MEK-ERK信号通路被广泛研究。RAS家族蛋白的突变和由此导致的信号通路的失调与多种癌症有关。因此，该通路是抗癌药物开发的热门靶标。

然而，寻找针对RAS家族的药物的开发和研究者面临重大挑战。RAS 蛋白是一种能以高亲和力结合 GTP 的小 GTP 酶(Promega GTPase-Glo™ Assay可用于药物研发中GTP酶活性的检测)，其上可供小分子抑制剂作用的可及位点非常有限。因此，RAS历来被认为是一个不可成药的靶标（2）。尽管采用靶向蛋白质降解来破坏RAS异构体的新方法展现出一些前景，但大多数药物发现工作都集中在信号通路下游成员上。由于RAF紧邻RAS下游起作用，因此人们已投入大量精力寻找有效的RAF小分子抑制剂。

在哺乳动物中，已知有三种RAF同工型，它们来自三个独立的基因：ARAF、BRAF和CRAF。BRAF突变是常见的致癌驱动因素，可直接或间接激活RAS-RAF信号复合物，并且BRAF已被广泛研究（3）。RAF同工型包含三个高度保守的区域，即CR1、CR2和CR3（4）。CR1包含一个主要和次要的RAS结合域。主结合域与活化的GTP结合形式RAS相互作用，次要的富含半胱氨酸的结构域对于 CR1 区域与位于 CR3 区域内的激酶结构域之间的相互作用至关重要（3）。

CR2区域与称为14-3-3的调节蛋白家族相互作用，在“闭合”构象下形成非活性 RAF 二聚体（3）。激活的RAS的结合，以及随后的几个磷酸化和去磷酸化事件，导致二聚化、高度活跃的“开放”RAF构象。尽管所有的RAF单体都可以形成同型二聚体和异型二聚体，但BRAF：CRAF异型二聚体在激活MEK方面是最有效的（5）。

大多数药物发现工作都集中在BRAF变体上，因为它们在各种人类癌症中具有致癌作用。几种选择性BRAF激酶抑制剂在BRAF突变癌细胞中有效，但它们不会阻断RAS突变细胞中的ERK激活（6）。此外，这些第一代抑制剂会在RAS突变细胞中促进依赖于RAS的RAF二聚化，并最终可能导致RAF-MEK-ERK通路的激活——所谓的“RAF抑制剂悖论”（5，6）。

因此，出现了替代药物开发策略，以避免RAF抑制剂悖论(5)。“泛RAF抑制剂”同时靶向有活性的RAF二聚体和单体，将RAF蛋白锁定在会诱导RAF二聚化但不会激活ERK信号的构象。而 “悖论破解剂”与BRAF单体结合，阻止二聚化，并且不激活ERK信号。

这些药物开发策略依赖于灵敏、准确的方法来测量活细胞内活跃 RAS-RAF 复合物内的药物靶点占有率。Promega和Vibliome Therapeutics的科学家最近合作，旨在基于 NanoBRET™ 靶标结合（NanoBRET™ TE）技术，在 HEK293 细胞中开发出这样的检测方法(7)。

https://doi.org/10.1016/j.chembiol.2023.07.019

“了解小分子RAF抑制剂如何与所有三个RAF同源物结合对于开发针对这一家族的下一代药物至关重要，”Vibliome生物部副总裁、该论文的共同通讯作者Aaron Crapster博士说。“泛RAF抑制剂以及同源选择性抑制剂（例如CRAF选择性抑制剂）都很有意义。”

该方法使用基于来自NanoLuc^®-RAF单体的能量转移供体的条件性BRET报告系统。细胞可渗透的、ATP 竞争性的荧光探针可以测量活细胞中内源性 KRAS（低 RAS）或未标记 KRAS 突变体（高 RAS）表达时，在发光复合物上的结合情况。因此，该方法可在KRAS-RAF复合物中实现BRAF、CRAF或ARAF的定量、单体选择性读出。通过这种方法，该研究报告了在存在KRAS热点突变等位基因的情况下，RAF二聚体抑制剂对BRAF/CRAF与BRAF/ARAF异二聚体的相对选择性(7)。

参考文献

1. Johnson, G.L. and Lapadat, R. (2002) Mitogen-activated protein kinase pathways mediated by ERK, JNK, and p38 protein kinases. Science 298, 1911–1934.

2. Fernández-Medarde, A. et al. (2021) 40 years of RAS—a historic overview. Genes 12, 681.

3. Matallanas, D. et al. (2011) Raf family kinases: old dogs have learned new tricks. Genes Cancer 2(3), 232–260.

4. Zhao, J. and Luo, Z. (2022) Discovery of Raf family is a milestone in deciphering the Ras-mediated intracellular signaling pathway. J. Mol. Sci. 23, 5158.

5. Cook, F.A. and Cook, S.J. (2020) Inhibition of RAF dimers: it takes two to tango. Biochem. Soc. Trans. 49, 237–251.

6. Cox, A.D. and Der, C.J. (2010) The Raf inhibitor paradox: unexpected consequences of targeted drugs. Cancer Cell 17, 221–223.

7. Vasta, J.D. et al. (2023) Protomer selectivity of type II RAF inhibitors within the RAS/RAF complex. Cell Chem. Biol. 30, 1–12.

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