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在MAPK通路中，RAS-RAF-MEK-ERK信号通路被广泛研究。RAS家族蛋白的突变和由此导致的信号通路的失调与多种癌症有关。因此，该通路是抗癌药物开发的热门靶标。
NanoBRET™ TE 是Promega药物研发的金牌技术之一，可以检测小分子化合物与靶点之间的亲和力和占有率，目前已经可以提供多种靶点相关的检测试剂盒，包括激酶、BET/BRD、HDAC、E3 Ligases、 NLRP3、PARP、GPCR和HSP等。现发布RAS/RAF靶点检测新产品：
• 活细胞水平：检测全长ARAF、BRAF、CRAF和多种RAS变异体细胞内化合物亲和力和占有率；
• 方便即用：采用简单的 “添加-读取”的工作流程；
• 仪器兼容：无需特殊仪器，只需具有发光检测功能的多功能检测仪；
• 检测二聚体形式的RAF：评估RAF同源二聚体（BRAF和CRAF）或RAF异源二聚体（ARAF、BRAF和CRAF）中RAF单体的靶标结合情况；
• 检测跨多种 RAS 变异体：包括 KRAS、HRAS 及热点突变体。
Principle
检测原理
与使用 NanoLuc® 萤光素酶靶点融合蛋白作为 BRET 供体的方法不同，NanoBRET™ TE Intracellular RAS/RAF Assay使用 NanoLuc® Binary Technology（NanoBiT）来检测多聚体 RAS 的细胞内靶标结合，这是一种由大萤光素酶亚基（LgBiT）和小互补肽（SmBiT(q)）组成的结构互补系统。
NanoBRET™ TE Intracellular RAS Assay检测原理：LgBiT -全长 RAS 的融合蛋白与 SmBiT(q) -全长 RAS 的融合蛋白在细胞中共表达。当 RAS 蛋白产生相互作用并形成多聚体时，LgBiT 和 SmBiT(q) 亚基聚集在一起形成作为 BRET 供体的活性萤光素酶。能量受体是一种可渗透细胞的荧光 NanoBRET™ tracer，专门与 RAS 结合。与 RAS 结合的化合物的添加会导致tracer的替换和剂量依赖性 BRET 信号的下降。
01
化合物在多种RAF构型中的活性
NanoBRET™ TE Intracellular RAF Dimer Assays可以使用相似的工作流程来评估测试化合物在多种 RAF 构象下的活性。这里展示了RAF二聚体抑制剂TAK-632（图A）和LXH254（图B）的活性谱示例。这两种抑制剂都可以与所有RAF二聚体结合，但两种化合物对CRAF同源二聚体和ARAF单体的亲和力较弱。
02
不同RAS变体的化合物选择性检测
NanoBRET™ TE RAS Assay允许使用相同的工作流程和2µM的恒定tracer浓度，对测试化合物在多个RAS变体中的选择性进行评估。这里显示的是Sotorasib（图A）和MRTX1133（图B）在全套可用的RAS融合载体中的选择性曲线图。Sotorasib对G12C热点RAS突变体具有强烈的选择性，而MRTX1133可有效作用于其预期靶点KRAS（G12D）和许多其他KRAS变体。
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