关键词：活细胞，高分辨率成像，标准共聚焦成像，快速单分子标记，高信噪比与特异性

基于HaloTag^®蛋白标签技术开发的Janelia Fluor^® HaloTag^® Ligands，是专为在内源性环境下表征HaloTag^®融合蛋白而设计。这些染料涵盖了整个可见光谱范围，凭借其独特的荧光生成特性与多用途性能及细胞通透性，使其成为标记细胞内蛋白质的理想选择。Janelia Fluor^® HaloTag^® Ligands适用于活细胞高分辨率成像和标准共聚焦成像，可实现快速单分子标记，具有高信噪比与特异性等特点，且相较于荧光蛋白增强了亮度。

Janelia Fluor^® HaloTag^®染料已应用于多种成像方法，包括针对固定细胞样本、活细胞以及体内样品的重要实验技术：

• 超分辨率和高分辨率成像

• 标准共聚焦成像

• 流式细胞分选（FACS）

• 荧光成像仪下的凝胶内检测

Janelia Fluor^®和JFX染料（Janelia Fluor^®染料的类似物）的一个显著特点是支持通过脉冲-追踪标记法进行不同颜色配基的顺序标记，这一特性有助于实时监测蛋白质动态变化，如转运和周转过程。

新型、无DMSO、冻干粉形式的Janelia Fluor^® HaloTag^® Ligands，旨在优化您的实验流程并最大程度减少浪费。冻干形式具有以下优势：

• 简化的实验流程：配基可以直接在水性溶液中重新溶解（包括细胞培养基）。

• 去除有机溶剂：不再需要可能干扰实验的有机溶剂。

• 精确定量：每个小瓶内均含有恒定数量的冻干粉配体。

• 透明包装设计：透明的小瓶使得配基清晰可见，有助于您准确、自信地进行准备工作。

• 单独分装：高效进行多个实验，减少浪费与资源消耗。

在本实验中，亲代U2OS细胞和稳定表达带有三个核定位序列的HaloTag^®蛋白融合体的U2OS细胞均贴壁培养在玻璃底室温载玻片上。然后将这些细胞在37°C + CO₂的细胞培养箱内，用Janelia Fluor^® 503、Janelia Fluor^® JFX 554或Janelia Fluor^® 635 HaloTag^®配基分别标记30分钟。随后，将细胞培养基替换为不含酚红的培养基。利用以下激光激发波长对细胞进行成像：针对Janelia Fluor^® 503 HaloTag^®配基，采用488nm激光激发（图A）；对于Janelia Fluor^® JFX 554 HaloTag^®配基，使用561nm激光激发（图B）；而对于Janelia Fluor^® 635 HaloTag^®配基，则应用637nm激光激发（图C）。结果显示，在表达HaloTag^®的细胞中，荧光标记仅限于细胞核内；而未表达HaloTag^®的亲代细胞则无任何标记现象。所有图像均通过配备有40X油镜的尼康AX/AXR共聚焦显微镜收集得到。

使用CRISPR/Cas9技术对HEK293细胞进行了基因编辑，在内源性BRD4蛋白的N端标记HaloTag^®。编辑后的细胞池用Janelia Fluor^® 646 HaloTag^®配基进行标记，并利用BD FACSMelody™流式细胞分选仪进行单克隆分离。在细胞群体扩增之后，使用Janelia Fluor^® 646 HaloTag^®配基标记表达HaloTag^®的克隆细胞以及亲代HEK293细胞，都在BD LSRFortessa™流式细胞仪上进行了流式细胞术分析。

结果显示，那些表达内源性BRD4蛋白与HaloTag^®蛋白融合体的克隆细胞群（蓝色直方图）相较于被同样标记了Janelia Fluor^® 646 HaloTag^®配基的亲代HEK293细胞（粉色直方图），其平均荧光强度显示出五倍左右的显著偏移（增强了五倍）。

Promega公司是为生命科学产业提供创新型解决方案和技术支持的领导者。公司拥有4,000多种产品组合，为细胞生物学、DNA、RNA和蛋白分析、药物开发、遗传鉴定和分子诊断等多个领域的生命科学工作提供支持。40多年来，这些工具和技术的应用领域不断拓展，如今已被实验室科学家和技术人员用于学术和政府研究、法医学应用、制药、临床诊断以及农业和环境监测等。Promega公司总部位于美国威斯康星州麦迪逊市，在16个国家设有分公司，在全球范围内还有50多个经销商。请访问www.promega.com，以了解更多信息。