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HaloTag®蛋白标签技术
HaloTag® Technology
蛋白标记和分析的强有力工具！
将您感兴趣的蛋白与HaloTag蛋白融合，实现包括蛋白纯化、蛋白相互作用、细胞成像、受体内化等多方面的应用。
蛋白标记
label proteins
HaloTag® 细胞成像
HaloTag® Imaging
| HaloTag®技术为在活细胞中和体外进行快速、定点标记HaloTag®融合蛋白提供了新的选择。该技术基于HaloTag®蛋白和合成配基之间形成的共价键，这些配基具有多种功能，包括荧光标记、亲和标记和附着在固相载体上；而共价键在生理条件下可迅速形成，且具有高度特异性和本质上的不可逆，形成的复合物即使在变性条件下也是稳定的。因此，使用HaloTag®只需要一个可以表达的单一融合结构，用任何一种荧光分子标记，即可在活细胞或固定细胞中进行成像。 |  |
细胞标记成像简要流程
使用HaloTag®融合蛋白和HaloTag®荧光配基进行细胞成像。您可以对洗涤或未洗涤的细胞进行成像，以确定亚细胞定位。
细胞成像应用示例
使用HaloTag®荧光配基进行活细胞或固定细胞成像
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| HaloTag®配基标记活细胞，之后进行固定。HaloTag®基因与3拷贝核定位序列融合后，稳定转染HEK293细胞，未转染的HEK293细胞作为对照；其中用HaloTag®TMR标记如图A所示， HaloTag® diAcFAM标记如图B所示， HaloTag® Coumarin 标记如图C所示或HaloTag® Oregon Green®标记如图D所示。 | |
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| 对表达核内 HaoTag®蛋白的 U20S 细胞进行活细胞标记。将亲本 U20S细胞和表达 HaloTag®(含有核定位序列)的 U20S细胞贴壁至玻璃底腔室载玻片上，并用 200nM Janelia Fluor®549 HaloTag®配基或 Janelia Fluor®646 HaloTag®配基标记 15 分钟。然后在以下条件下进行成像：对于 Janelia Fluor®549 HaloTag®配基，用 561nm 波长的激光激发(A)，而对于 Janelia Fluor®646 HaloTag®配基用 637nm 波长的激光激发(B)。在表达 HaloTag®的细胞中标记部位仅限于细胞核。亲代细胞(图中的活细胞对照)未显示出标记。各图的第一行仅为荧光信号。底行显示的则是在同一相应激光激发波长处收集的透射图像，且荧光图像与之叠加。使用了带 NS Elements 软件和 40X plan fuor 油漫物镜的 Nikon Eclipse Ti 共聚焦显微镜进行图像采集。 | |
研究膜蛋白的定位和运输
Investigate Membrane Protein Localization
使用一种不能进入细胞的荧光配基来标记与HaloTag®蛋白融合的靶标膜蛋白，以此检测受体的运输。HaloTag®报告基因蛋白和配基之间的共价键意味着即使在固定细胞所需的变性条件下，您也可以确定您的蛋白质是否仍然存在于膜中，或者是否发生了周转或内化。这些非细胞渗透性的HaloTag®配基共价结合到HaloTag®蛋白上，您可以在严格的实验条件下分析蛋白质。
 | 细胞表面HaloTag®融合蛋白的活细胞标记。图 A和B显示的是：稳定表达HaloTag®-ECS(细胞外表面；由信号序列和b1-整合蛋白的单个跨膜结构域组成)融合蛋白的HEK293细胞，使用HaloTag®Alexa Fluor®488配基标记并成像。图 C和D显示的是：表达HaloTag®-EDG1 (GPCR受体)融合蛋白的U2OS细胞，使用Alexa Fluor®660配基标记并成像。共聚焦图像显示，荧光(图A和C)仅限于细胞表面，在DIC/荧光叠加的图(图B和D)也可以清楚地看到。图像是在Olympus FV500共聚焦显微镜上使用适当的滤光片组合生成的。 |
与免疫细胞化学叠加检测
Multiplex Using Immunocytochemistry
通过使用Anti-HaloTag® Polyclonal Antibody和一种二抗使得与荧光配基共标记HaloTag®融合蛋白成为可能。确保您的蛋白在体内已被HaloTag®配基特异性标记，尤其是当二抗使用光谱不同的荧光基团进行免疫细胞化学检测(ICC)时。HaloTag®配基可以与活细胞一起使用，然后使用Anti-HaloTag® pAb将细胞固定用于ICC。ICC标记是特异性针对HaloTag®蛋白的，这样可以减少背景着色。
 | HaloTag®-p65融合蛋白与HaloTag®TMR配基和Anti-HaloTag®pAb共标记。用5µM HaloTag® TMR配基标记细胞15分钟，轻柔洗涤后用2µg/ml 带有AlexaFluor® 488的抗兔IgG (Invitrogen)孵育。最后，用DAPI (Vector Laboratories)对细胞进行复染。图像用奥林巴斯IX81落射荧光显微镜收集，设置对罗丹明和AlexaFluor®488适合的滤镜。图A. 使用HaloTag® TMR配基对HEK293-p65-HT2细胞进行胞质(红色)标记。图B. 使用Anti-HaloTag® pAb进行胞质(绿色)标记。图C. 配基和抗体结合活性的共定位。图D. 红色和绿色荧光的叠加与DAPI对细胞核的复染(蓝色)。箭头表示很少或不表达HaloTag®-p65的罕见细胞。 |
