制备靶蛋白的常用方法是用质粒转化大肠杆菌细胞并诱导蛋白表达。 这种重组蛋白通常带有一个标签，这有助于将其从大肠杆菌中发现的其他蛋白中提纯出来。HaloTag^®介导的蛋白纯化技术以共价结合为基础，其甚至能有效捕获丰度较低的融合蛋白。通过这种共价结合方法，可进行多次洗涤操作，从而最终达到除去污染物的目的。事实上，经证实HaloTag^®技术可提高大肠杆菌中可溶性蛋白的表达水平。

1. 基本原理

HaloTag^®Protein Purification System以新型HaloTag^®蛋白标签为基础，通过共价结合可有效且特异性捕获HaloTag^®融合的靶蛋白。使用HaloTag^®技术进行纯化，可获得高产量和高纯度的靶蛋白，而且不会残留HaloTag^®蛋白标签。这一结果通过共价捕获融合蛋白及后续采用以下方法释放靶蛋白而实现：TEV蛋白酶切割HaloTag^®Flexi^®Vector中嵌入的优化TEV识别序列。

靶蛋白（POI）与HaloTag^®蛋白融合，然后与HaloLink™Resin发生共价结合。这种共价交联方法可在严格洗涤条件下使POI附着在树脂上。洗涤后，通过TEV蛋白酶切割进行POI洗脱处理。

2. HaloTag^®与其他蛋白标签系统的比较

在基于平衡反应的亲和纯化方法中，蛋白在两种状态之间不断变化，即与亲和树脂发生结合或不与之发生结合（例如，GST与GSH树脂结合，His-Tag^®与Ni2+带电载体结合）。这可能会导致一些问题，比如当融合蛋白表达量低时，结合效率也随之降低，以及在多次洗涤过程中靶蛋白发生损失。此外，往往需要从靶蛋白除去GST和MBP等较大的融合标签，通常采用的方法是使用特异性蛋白酶进行切割及后续通过亲和方式除去游离标签。后一个步骤可能会存在一定问题，因为标签本身很难进行消除，因此其会成为最终纯化蛋白中的污染物。

以HaloTag^®技术为基础的纯化方法，因其可共价捕获蛋白，因而非常适用于解决常见的蛋白纯化问题。

• 回收低表达蛋白。共价蛋白捕获导致固定化过程不可逆，因此融合蛋白的结合受表达水平的影响较小，从而可对低表达蛋白进行纯化。
• 高纯度蛋白，蛋白产量良好。HaloTag^®捕获标签因共价永久性结合，在柱上TEV蛋白酶切割后仍留在HaloLink™Resin上，所以可进行多次严格洗涤，同时使靶蛋白损失降到最小。在除去TEV蛋白酶后，可回收靶蛋白，通常其产量高，纯度也较高。
• 除去多余蛋白。HaloTag^®共价键强度较高，因此可在需要时进行严格洗涤，从而除去潜在的多余蛋白。

凝胶成像系统中，按照说明书（编号：TM312）中所述的批量/柱组合法，使用1ml沉淀的HaloLink™Resin从50ml培养物中纯化萤火虫萤光素酶（ffLuc）。SDS-PAGE分析结果显示，纯化蛋白的纯度高（>90%），通过比较E2和S-TEV中Coomassie®染色的ffLuc谱带强度，确定其回收率也很高。活性蛋白的回收率大于起始材料的75%（E2对比S-TEV），这表明其可有效捕获融合蛋白以及通过TEV蛋白酶切割实现蛋白释放。 Read the paper

对于难以在细菌细胞中进行表达的蛋白，或者如果蛋白翻译后处理对下游应用而言较为重要，可在哺乳动物细胞中表达并从哺乳动物细胞中分离出标记蛋白。HaloTag^®Mammalian Protein Purification System可从哺乳动物细胞培养裂解物中纯化HaloTag^®融合蛋白。HaloTag^®融合蛋白可与HaloLink™Resin形成高度特异性的共价键，甚至能够在培养的哺乳动物细胞中实现对表达水平较低的重组蛋白的良好纯化。与其他常见纯化方法（如FLAG^®标签或His标签蛋白纯化）相比，HaloTag^®-配体结合的特异性和强度可显著提高功能蛋白的产量和纯度。具体如下所示：

• 以最小的代价获得高纯度蛋白
• 与FLAG^®和His标记方法相比，回收率更高
• 可从µg级扩大到mg级
• 便捷的荧光蛋白定量方法

1. HaloTag^®Mammalian Protein Purification System概述

2. 以最小的代价获得哺乳动物细胞中的高纯度蛋白

Ohana等人使用HaloTag®Mammalian Protein Purification System分离出了高纯度、无标签的靶蛋白。与使用3xFLAG或His6tag系统等亲和标签获得的蛋白产量相比，使用HaloTag®系统时，蛋白回收率更高，产量也更高。此外，在纯化低丰度蛋白时，HaloTag®的表现也优于3xFLAG和His6tag系统。 根据凝胶成像系统所示，在HEK293T细胞（120ml培养物）中瞬时转染、表达，并用HaloTag®Mammalian Protein Purification System纯化了五种HaloTag®融合的人类激酶。 Read the paper