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RAS通路
RAS Pathway
选择合适的检测方法对RAS信号通路药物开发研究非常重要。Promega可为您提供多种检测试剂盒和先进技术来助力RAS药物的研发。这些检测试剂盒可检测化合物与通路组分的结合，并评估它们对蛋白质相互作用、蛋白质水平以及最终ERK激活的影响。
蛋白降解
Protein Degradation
通过使用CRISPR/Cas9基因编辑技术在内源性目标位点敲入生物发光标签，天然启动子表达的蛋白质可以通过简单的光输出检测进行研究。与过表达模型相比，内源性标记的蛋白质与天然相互作用的伴侣蛋白质保持自然的表观遗传调控和化学计量，从而改善了检测窗口，最大限度地减少了伪影，以及在生理相关条件下可创建更准确的蛋白质生物学模型。
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| 利用HiBiT： LgBiT互补研究细胞内的蛋白质降解的原理图 | 延时活细胞成像。将CRISPR-HiBiT BRD4细胞用MZ1（一种BET溴结构域降解剂）处理。在2小时内观察到BRD4的均匀损失。使用OlympusLV200 系统进行成像。 |
用于 RAS 通路靶标的HiBiT Knock-in细胞系
HiBiT是研究内源性蛋白降解的常用标签。HiBiT是含有11个氨基酸的小肽，可与称为LgBiT的大亚基以高亲和力结合。结合形成的复合物具有高萤光素酶活性，在添加底物的情况下会产生明亮的发光信号。与较大的标签相比，HiBiT的小分子量可以更加高效地敲入基因，而无需分子克隆步骤，这也使其非常适合CRISPR/Cas9基因编辑工作流程。
添加引起降解的化合物会导致发光信号丢失，这些发光信号是高度定量的并且可以进行实时检测。检测者可以在24-48小时内监测并获得细胞剂量反应曲线，从而准确测定降解率、Dmax、DC50值以及蛋白回收率。这种方法允许针对一系列不同参数对降解进行快速排序，并且该检测适用于高通量筛选。
上图. PROTAC处理后内源性HiBiT-KRasG12C的活细胞降解动力学。A. HiBiT通过CRISPR/Cas9插入到MIA-PaCa2细胞系内源性KRasG12C基因座的N端。在LgBiT表达后，使用基于VHL的KRasG12C PROTAC：LC-2，在含 Nano-Glo® Endurazine™ Substrate的培养液中（CO2非依赖性）进行剂量响应动力学降解实验。RLU是相对于DMSO对照绘制的。B. 在MIA-Paca2细胞中使用亲本抑制剂MRTX849对HiBiT-KRasG12C进行了类似的活细胞发光研究，在相同的剂量反应处理中，没有显示KRasG12C的损失。
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